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Ⅰ 如何筛选出带有突变DNA序列的突变体

如何筛选出带有突变DNA序列的突变体
PCR扩增技术中，终产物一般是位于两端扩增引物中间的序列片段。如果用AD做引物，第一个问题是扩增效率问题，普通PCR酶一般仅支持2KB以下产物长度，再往上需要特殊的酶，但一般也就是10个kb，而AD间是T-DNA全长，一般比较长，普通PCR是扩增不成功的；其次是能否获得产物的问题，就算你能够把整个AD段扩增成功，扩增产物中会有非常多的AD间序列，极少量的既有AD又有部分BC的序列，二者之间的比例会是2的20次方倍以上，这与你的PCR循环次数设定有关。所以用AD扩增，BC间序列被进一步稀释，还不如不做PCR了。这里就要说一下PCR的原理了，从A引发的新DNA链的合成，在D不会终止，但因为从D引发合成的新链D1没有D后面的片段，以D1为模板，从A引发的新新链A2D1就不会含有D后面的片段，这样，第一次循环后，产物中有一半缺乏D后片段，第二次循环后，产物中有四分之三缺乏D后序列，第n次循环后，产物中有1减2的n次方的比例缺乏该片段，到时候你怎么检测如此低比例的东西呢？对于A后面的片段也是如此。所以，用AD富集的产物与BC正相反，所以用BC而非AD。

Ⅱ 有一种果蝇的猩红眼突变体，其眼色与野生型果蝇不同．现有两个实验室又分别发现并分离了两个新的突变品系

（1）根据猩红眼的基因型为aa，说明野生型的基因型为AA或Aa，所以出现第一只猩红眼突变体（基因型aa）最可能的过程Aa×Aa→aa，遗传图解见答案．
（2）朱砂眼-1和朱砂眼-2分别与野生型杂交的后代均是野生型，说明隐性性状是朱砂眼，在子一代没有表现出来．
（3）①实验二：朱砂眼-2与猩红眼的杂交后代均为野生型，说明野生型为显性性状，朱砂眼-2和猩红眼为隐性性状，并且朱砂眼和猩红眼为非等位基因，由上述结果可知，实验二杂交产生的野生型果蝇，其基因型是AaBb．
②由实验三可知，朱砂眼-1基因与朱砂眼-2基因互为等位基因．
③取实验一杂交后代的雌雄个体进行繁殖，果蝇的基因型为AaBb，AaBb×AaBb→9A_B_（野生型）：3A_bb（朱砂眼-1）：3aaB_（猩红眼）：1aabb（朱砂眼猩红眼），所得后代中野生型的比例为

Ⅲ 植物体细胞无性系突变体筛选的方法有哪些

体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：一种是Chaleff（1981）提出的以R0、R1、R2、…分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；另一种是由Larkin和Scowcroft（1983）提出的以SC1、RC2、RC3、…来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代.现在,这两种表述方式在体细胞无性系变异研究中均有应用.离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点：（1）由于筛选可以在离体条件下进行,从而可以在小空间内对大量个体进行选择.（2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成,且不受季节限制,因此筛选效率高.（3）因为试验是在人工设计的培养条件下进行的,因此诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控制,从而提高了试验的重复性.（4）由于变异是在单细胞水平上进行的,因此,一个突变体就是来自一个细胞,不会有非突变细胞的干扰,避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体,因而可以省去变异分离的麻烦.（5）在细胞培养系统中,理化诱变剂可较均匀地接触细胞,因此可以引起培养细胞相对较高频率地发生突变,增加了选择机会.一、体细胞变异诱导材料的选择选择起始材料需根据试验目标确定,一般需考虑以下几方面的问题：其一,目标性状的可行性.体细胞突变的频率虽然较高,但对于某一个体来讲,变异的性状是个别的,因此选择综合性状良好的植物品种材料,通过诱变改变个别不良性状,是体细胞突变系选择的目的.其二,必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平,只有对起始材料有良好的培养技术,才有可能制定完满的诱变及选择方案.如果起始细胞的培养技术不成熟,不能再生整株,则不能进行后续的各项操作.其三,适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件.二、培养细胞的自发变异离体培养的植物细胞会出现较高频率的自发变异,离体培养中体细胞自发突变所产生的变异往往比较稳定,没有人工诱变的后续干扰,有利于分离和选择.育种家们应用自发突变的这些优点,已选育出一些新品种,如美国RNA植物技术公司已从番茄体细胞无性系变异中选育出新品种,台湾的育种家也从甘蔗体细胞无性系再生植株变异中选育出新品种

Ⅳ 求《突变体》这部电影的字幕文件！！

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Ⅳ 一批纯合野生正常翅（h）果蝇中，出现少数毛翅突变体（H），在培养过程中，由于某些因素刺激，可能重新恢

（1）由题意已知纯合野生正常翅（h）果蝇中，出现少数毛翅突变体（H），若是体内另外一对基因RR变为rr，从而抑制基因H的表达，即毛翅基因型中有H没有r，所以毛翅果蝇的基因型可能为：HhRR、HhRr、HHRR、HHRr．
（2）基因型相同的纯合果蝇回复体可能是真回复体，也有可能是假回复体（HHrr），可以基因型为HHrr的个体与之交配，如果后代全部为毛翅（HHrr），说明则这批果蝇是假回复体；如果后代全部为正常翅，则说明这批果蝇为真回复体．
（3）若实验结果表明这批果蝇为假回复体（HHrr），想进一步检测这两对基因是否在一对同源染色体上，可以设计实验如下：使假回复体（HHrr）与野生正常翅果蝇（hhRR）杂交，得到F1代（HhRr），再让F1雌雄杂交，产生F2代，如果后代毛翅：正常翅比例为9：7，则说明两对基因分别位于两对染色体上．
故答案是：
（1）HhRR、HhRr、HHRR、HHRr
（2）HHrr正常翅毛翅
（3）使假回复体与野生正常翅果蝇杂交，得到F1代
F1雌雄杂交，产生F2代
毛翅：正常翅比例为9：7

Ⅵ 水杨酸能使植物获得系统获得性抗性，运用正向遗传学方法设计筛选具有系统获得性抗性的水杨酸突变体的方案

影响表达的所需基因在大肠杆菌中的因素？浏览次数：904次标签：|提问时间:2009-4-28 17:30 |提问者：lys2126
因素会影响目标基因在大肠杆菌中表达？

推荐答案（1）外源基因拷贝数的
（2）外源基因的表达效率
①启动子强度
有效②核糖体结合位点性别
③SD序列和起始密码子ATG间距
④密码子的
⑶表达了产品的稳定性
（4）细胞代谢负荷
⑸工程菌培养条件
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建立一个载体，目的基因表达在植物根系和根细胞外分泌。请注明步骤次数：842悬赏分：20 |解决问题
时间:2009-2-14 09:13 |提问者：370 629 225
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建立特定的外源基因的植物表达载体，并转移到受体植物，没有植物遗传转化的最终目标。理想的转基因植物通常需要高水平的表达的外源基因在一个特定的地点和一个特定的时间，人们期望的表型性状。然而，近二十年的发展历程中经常表达效率低，表达产物不稳定，甚至基因失活或沉默等不良现象，转基因植物外源基因在受体植物不能被投入实际应用。此外，转基因植物的安全性问题已经引起许多国家的关注，例如，转基因的花粉传播，抗生素选择标记基因可能使某些抗生素的临床没用。使这种高科技植物基因工程的出现，是在一个前所未有的时期困扰着上述问题。为了解决这些问题，在最近几年中，人们种植转基因技术，广泛的植物表达载体的探索??和改进，改善和优化是最重要的内容之一，本文已取得的进展进行了综述。

外源基因表达水平的1启动子的选择和转化往往是不理想的重要原因，转基因植物。发起人确定的基因表达中发挥关键作用，因此，选择合适的植物启动子，以提高其活性，是首先要考虑的问题，提高外源基因的表达。
本植物表达载体中，广泛使用的启动子是组成型启动子，例如，大多数双子叶使用的CaMV35S启动子的转基因植物，单子叶植物的转基因植物是主要用于从玉米泛素启动子，和从水稻Actinl启动子。外源基因在转弯的控制下，这些组件中的表达的启动子，表达的转基因植物和所有发育阶段的所有部分。但是，表达的外源基因在受体植物持续和有效的，不仅造成浪费，往往还会引起植物的形态变化，影响植物的生长和发展。为了有效地发挥作用的植物，而在同一时间，以减少不利影响的厂房，特异表达启动子的外源基因的研究与应用越来越重视。业已发现，特定的启动子，包括器官特异性启动子，诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子，果实特异性的启动子，叶肉细胞特异性启动子，根特异性启动子的特异性启动子的损伤，化学诱导的特异性启动子的光诱导特异性启动子，热休克诱导特异性启动子。特异性启动子的克隆和为特定的外源基因在植物中的表达奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY PR-IA启动子控制的转基因烟草中Bt毒蛋白基因表达，启动子水杨酸及其衍生物诱导喷酒很便宜，无污染的化学物质，诱导抗性基因表达的害虫再次发生本赛季，显然是一个非常有效的方法。
植物转基因研究中，往往不能达到满意的效果，尤其是在使用天然启动子特异性表达和诱导表达，表达水平大多不太理想。要改造现有的启动??子构建复合启动，将是一个非常重要的途径。例如Ni等的转录激活区的章鱼碱合成酶基因的启动子和甘露碱合成酶基因启动子的化合物的启动子，GUS表达的结果示出：改造后的启动子活性比35S启动子的显着改善。吴瑞等人将操作诱导型PI-II基因启动子的水稻Actinl内含子的组合，一种新的表达的启动子活性增加了近10倍（专利）。在植物基因工程研究，这些人工形成的启动发挥了重要作用。

建设载体，以提高效率外源基因的翻译，通常是基因改造，主要考虑三个方面：
2.1提高翻译效率5'-??3 ' - 非翻译序列
许多实验，已经发现，真核基因的5'-3'-非翻译序列（UTR）的基因的正常表达是非常必要的，该区域的情况下往往会导致的mRNA的稳定性和翻译水平的显着降低。例如，在126kDa蛋白基因的烟草花叶病毒（TMV）的翻译起始位点的上游由68bp核苷酸Ω元件，该元件提供了一个新的核糖体结合位点，使格斯基因翻译活动提高数十倍。有很多的载体外源基因的5'-端加Ω翻译增强子序列。 ingelbrecht告诉进行过研究的各种基因的3'-末端序列，并发现，章鱼碱合成酶基因的3'-末端的序列使NPTII基因的瞬时表达在超过20倍的增加。此外，的不同的基因的基因表达增强的效率，在对基因表达的促进效果的不同，例如，rbcS3'-末端序列的3'-端序列的查耳酮合成酶基因的3'-末端的60倍以上序列。
2.2优化起始密码子周边序列
虽然在生物圈中的起始密码子是常见的，但是，从不同生物来源的基因有其特殊的外部起始密码子序列。例如，植物起始密码子周围的序列的典型特征是AACCAUGC，动物的起始密码子周围的的序列CACCAUG原核生物与两者之间的差别较大。 Kozak的详细研究前的起始密码子的ATG相邻基地定向诱变，转录和翻译的影响，并总结出围绕ACCATGG在真核生物中，最有效的序列的转录和翻译起始密码子，特别是-3位A的词条效率是非常重要的。购买的序列的构建称为Kozak序列，被施加到该表达载体。例如，一种细菌几丁质酶基因，和原始的起始密码子周围的序列UUUAUGG，以ACCAUGG，8倍的烟草中的表达水平增加。因此，使用非植物来源的基因构建体的表达载体，应根据要变换的植物起始密码子周围的序列的特性。
2.3基因的编码区是为变换
如果外源基因是来自于原核生物，由于在这些基因在植物中的表达机制的差异的往往是非常低的表达水平，例如，来自苏云金芽孢杆菌野生型的杀虫蛋白质基因在植物中表达，是非常低的，研究发现原核基因和植物基因mRNA的稳定性的差异造成的，这是由于减少。孟山都公司Perlak人的前提下不改变的氨基酸序列的毒性蛋白，杀虫蛋白质的基因转化，植物优选的密码子选择，GC含量，和删除的影响mRNA的稳定性原始序列中的元素，结果中毒蛋白质在转基因植物中的表达增加了30到100倍的昆虫。
3
消除位置效应去除后的外源基因的受体植物，它往往是非常不同的表达水平在不同的转基因植物。这是主要的不同的插入位点的受体植物基因组中的外源基因的结果。这被称为“位置效应”。为了消除位置效应，外源基因是转录活性区域的植物基因组表达载体，在当前构建策略通常考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用能够集成。
核基质结合区（矩阵协会地区，MAR）是真核细胞的染色质核基质的特定部分相结合的DNA序列。一般MAR序列位于转录活性的DNA的环状结构和哉，其功能是使分裂的作用，从而使每一个转录单元从周围的染色质的影响，以保持相对的独立性的边界。该研究表明，在MAR放置在两侧含有MAR基因-MAR的结构的遗传转化到植物表达载体所需的基因构建，可以显著靶基因的表达水平的增加，减少目标基因之间的不同的转基因植物中的表达水平的差异，减少的效果的位置。例如，Allen等人研究的异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）Gus基因在烟草中的表达，发现，酵母MAR使能增加12倍的平均水平的转基因表达，烟草本身MAR使转基因表达平均水平增加了60倍。 MAR的鸡溶菌酶基因也可以起到同样的作用。
另一种可行的方法是使用定点整合技术，此技术的主要原理是，转化载体宿主的染色体，外源基因通过同源重组，定点整合染色体上特定DNA片段的同源性地区。实际操作中，当所述第一分离的染色体的转录的活性区域的DNA片段，然后构建了植物表达载体。同源重组在的微生物有针对性的整合已成为一项常规的基因操纵，已成功地在动物体内有针对性的整合外源基因在植物中的叶绿体表达载体，有针对性的外一体化的原子核变换方法还是很鲜有成功案例。
4构建叶绿体表达载体
往往是外源性的核转化为了克服基因的表达，由于不安全的性行为的问题，如核基因花粉散布的位置效应，在近几年才出现的低效率一种新的遗传转化技术 - 叶绿体转化是它的优势和发展前景，越来越多的认可和重视。到目前为止，已出版的5种继承叶绿体转化烟草，水稻，拟南芥，马铃薯和油菜（侯丙凯等），使得这种转换技术开始成为新的增长点，在植物基因工程。
已测由于各种植物叶绿体基因组序列的外源基因的定点整合到叶绿体基因组中同源重组机制奠定了基础，叶绿体表达载体当前的构建基本上都属于特定网站的整合载体。构建叶绿体表达载体基本上是一个指向例子载体。生成叶绿体表达载体一般外源基因的表达盒，每个连接期间叶绿体DNA序列的两侧，提到作为同源重组片段，或定位段（定向片段）。当载体导入到叶绿体中，由这两个片段具有相同的在叶绿体基因组中发生同源重组的片段，它是能够将外源基因整合到叶绿体基因组中的一个特定的地点。叶绿体转化在作物改良的目的，需要发生同源重组后，插入外源基因的叶绿体基因组的原始序列既不造成的损失，并且它不会破坏的功能的原始基因的插入点。为了满足这种要求，现有的工作被选择相邻的两个基因的同源重组的片段，如rbcL基因/ ACCD四16StrnV/rpsl2rps7 psbA基因/变异之，rps7/ndhB，。指定的外源基因的同源重组的发生后，插入在两个相邻的基因间隔区中，以确保基因的原始功能不受影响。最近，丹尼尔和其他用途的烟草叶绿体基因组中的tRNA和trnI同源重组片段，构建一个共同的载体（通用矢量）。在高等植物中，由于的的tRNA和trnI DNA序列是高度保守的，作者建议，这样的载体，可用于各种不同的植物叶绿体转化。如果这种载体的多功能性得到证实，那么这项工作无疑是构建一个新的，方便实用的叶绿体表达载体，提供了一个很好的主意。
外源基因的定点整合到叶绿体基因组中的表达往往由于叶绿体基因组拷贝数很高的，第一个例子中，麦克布莱德等人BT的cryIA（c）毒素基因导入烟草叶绿体Bt毒蛋白的高效率高达3％至5％的叶中总蛋白质的表达，而一个典型的核转化技术只能达到从0.001％至0.6％。最近，哥打京那，到烟草的Bt Cry2Aa2的基因导入烟草叶绿体还发现，烟叶中的毒蛋白的表达，占2％至3％的可溶性蛋白质，高20至30倍，比核转化，转基因烟草不仅抗敏感的昆虫，并能杀死那些对昆虫有一个高电阻的。斯托布近日报道，人类生长激素基因导入烟草叶绿体中的表达水平高达7％的叶蛋白，原子核变换方法的300倍以上。这些实验充分叶绿体表达载体的建设和改造，是实现高层次的表达外源基因的重要途径。
5定位信号的应用程序
以上几个向量优化战略的主要目的是为了提高外源基因的转录和翻译的效率，然而，高水平表达外源蛋白是否可以稳定在植物细胞中，其他重要的问题，需要考虑到在植物遗传转化的量的积累。
最近的研究发现，如果一定的外源基因被连接上的信号序列中的正确定位，使外源蛋白质产生定向运输到细胞内的一个特定的站点，例如：叶绿体，内质网，液泡等，可以显着提高系统的稳定性和外源蛋白的积累。这是因为特定区域？某些外源蛋白质的内质网内的环境中提供了一个相对稳定的，有效地防止外源蛋白质的降解。例如，Wong等人拟南芥Rubisco大亚基转运肽序列连接到专门的杀虫蛋白的转基因烟草叶绿体中积累的杀虫蛋白基因之前，总的外源蛋白的积累比对照组提高10到20倍。最近，叶亮，宋王艳茹的rbcS亚基的转运肽序列连接前PHB合成基因，试图使基因产品，在转基因油菜种子的质的积累，从而增加了外源性蛋白质含量。 ，万德尔特和思腾内质网定位的连接，并发现，在转基因植物中的外源蛋白的内容已被显着改善的外源蛋白质基因的序列（四肽KDEL的编码序列）。显然，定位信号了积极的作用，促进蛋白质的积累，但相同的定位信号是否适用于所有的蛋白质需要进一步确定。

6内含子增强基因表达的内含子增强基因的表达，最初是由Callis等人发现转基因玉米，玉米乙醇脱氢酶基因（ADHL）的第一个内含子（内含子1）表达外源基因显着增强，其他内含子的基因（例如子上，intron9的）也有一定量的促进效果。后来，瓦西尔列夫，还发现了第一个内含子的玉米果糖合成酶基因CAT的表达水平增加10倍。第三个内含子，水稻肌动蛋白基因，也可使由2?6倍的报告基因的表达水平增加。日期内含子增强基因表达的机制尚不清楚，但一般认为可能是存在的内含子提高了处理的效率和mRNA的稳定性的mRNA。 Tanaka等人，一些研究表明，内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物和双子叶植物中是不明显的。
由于内含子增强，麦克尔罗伊构建单子叶植物表达载体，特别是在保持在启动子下游的基因的基因表达的水稻肌动蛋白基因的第一内含子。同样，Christensen等人在所构建的载体玉米泛素的第一内含子的基因被置于启动子的下游，以提高在单子叶植物中的外源基因的表达。然而，研究指出，对基因表达的启动子强度，该信元类型，靶基因序列，等多种因素的影响取决于具体的内含子的作用，甚至有时依赖于载体中的内含子的位置。例如，玉米ADHL基因9置于Gus基因的5'末端，和表达的GUS基因的CaMV35S启动子的控制下，没有增强;时，内含子的3'端被放置在内含子gus基因，在相同的起始子的gus基因的表达水平的控制下，增加约3倍。内含子的基因表达的机制可能是非常复杂的，可以看出，内含子如何建立高效植物表达载体，是缺乏一个固定的模式，值得进一步研究。
多基因控制的政策
到目前为止，大多数是一个单一的外源基因导入受体植物遗传转化研究。但足够强大的，有时由于一个单一的基因的表达或一个单一的作用机制尚未获得??理想的转基因植物。如果两个或更多到植物基因的协同效应，在同一时间，将得到更可取比单基因的转换结果。这种策略已经应用如抗病，抗虫，抗逆的转基因植物的培育。例如，根据抗昆虫基因的昆虫频谱和作用的不同的机制，可选的两个函数互补基因的载体的构建，并通过某种方式的两个抗虫基因导入植物去。王伟和其他外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入到棉花已经包含双价抗虫性基因的转化植株。巴顿Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因导入烟草的同时，大大提高了抗虫性和能力，以防止害虫产生抗药性（专利）。在抗病性强，蓝燕我们的实验室建设含β-1，3 - 葡聚糖酶双价基因和几丁质酶基因的植物表达载体，并导入油菜和棉花，结果表明，转基因植物产生了显着的抵抗。近日，丰刀茸，李保建2?3个抗真菌病基因和hpt基因甚至在载体上，无论是昆虫抗性基因和bar基因连接到另一个载体，利用基因枪一起引入水稻结果表明，70％的R的后代包含导入的外源基因（6?7），和导入的多个外源基因的基因组位点中的一者或两者被集成在的倾向。
一般常规的转换，它是不能够超过25KB的外源DNA片段导入植物细胞。功能相关的基因，如数量性状基因座在植物抗病基因，该基因簇的形式主要入。如果某些大于100KB的大片段DNA，如天然植物染色体基因簇或不相链中的一个系列的外源基因导入植物基因组中同一个点，它可能会出现由多基因控制。优良性状或产生广谱的抗虫性，抗病性，还可以得到一个完全新的代谢途径的受体细胞中，产生新的生物分子。此外，的基因簇的大片段或基因簇的同步插入也可以在一定程度上克服由转基因带来的位置效应，减少基因沉默等不良现象发生。近日，美国汉密尔顿和阿尔弗雷德开发出新一代的载体系统，克隆大DNA片段和的帮助下农杆菌介导的直接转化植株BIBAC和TAC。这两家运营商不仅要加快基因的图位克隆，同时也为多基因控制，品种改良将具有潜在的应用。目前，多基因转化中的应用研究才刚刚开始。论BIBAC和TAC载体
8选择标记基因使用和删除的
选择标记基因的遗传转化中可以转化的细胞（或个人）从大量的非转化细胞中筛选出的标记基因。它们通常可以使产生的转基因细胞，有选择剂的产品的电阻，所以，转基因的细胞在正常的生长介质中，添加这样的选择由于缺乏抵抗力的非转基因的细胞表现出此选择剂敏感性，而不是生长，发育和分化。载体中，构建，选择标记基因的连接侧，两者都具有自己的基因调控序列（如启动子，终止子等）的目的基因。选择标记基因，有两个主要的类别：抗生素抗性基因，除草剂抗性基因。前者可以产生抗生素抗性，后者可产生耐药性的除草剂。使用的抗生素抗性基因，包括NPTII基因（潮霉素抗性），和Gent的基因产生潮霉素磷酸转移酶，新霉素磷酸转移酶，卡那霉素抗性），HPT基因（产生（反庆大ADM）。除草剂抗性基因，包括EPSP基因（产生5 - 丙酮酸莽草酸-3 - 磷酸合成酶，草甘磷），GOX基因（草甘膦氧化酶降解草甘膦），bar基因（产生PPT乙酰转移酶，的反Bialaphos或草铵膦）。

以上这1，2，3，5，6，他们都可圈可点，尤其是因为您要到胞外分泌的的骨架载体可以选择PB I121，然后你可以在上面的基因型的变化。

背后是克隆步骤都相对简单。
1第一限制性酶切位点，以获得所需的基因，加上传入变化的一个很好的载体。
2质粒转化大肠杆菌DH5α扩增
放大良好的质粒转化植物细胞
4的收集根外介质检测蛋白的表达和分泌。是否
至于转型的载体几步简单说说就可以了回答后， ，如果我们真的做一个很好的载体，可以打开自己的公司。